肝素酶的规模化生产及低分子量肝素制备技术
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肝素酶的规模化生产及低分子量肝素制备技术
1 成果简介
多年来,国际市场对肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是从动物内脏中提取加工而得的,产量受到一定限制,时常满足不了市场需求。自 20 世纪 90 年代后期开始,全球市场肝素需求大幅增加,我国肝素生产和出口连年均以较大幅度上升, 出口量和出口金额呈快速增长态势。中国已成为世界上首屈一指的肝素原料药出口大国。
肝素抗凝血药产品价格:注射用精品 8~10 美元/ mega,口服用为 7~8 美元/ mega,具有可观的经济效益。
肝素酶具有许多重要的医药用途,包括制备低分子量肝素,体外循环中肝素的消除,肝素精确结构的确定,制备抗肿瘤药物,抑制新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导血管内皮细胞的增殖等等。其中最重要的是制备低分子量肝素( LMWH)。采用酶法制备 LMWH反应条件温和, 与其他方法(物理分离法和化学裂解法)相比较,具有收率高,对环境友好,易实现生产连续化等优点。如果能够使用固定化肝素酶降解肝素,得到的产品和肝素酶易于分离,生产方便,而且酶可反复使用,还可进一步节约成本。因此有关肝素酶产品的生产倍受人们关注。
2 技术指标
在降解反应中, MBP-hepA 融合酶的最佳反应温度为 30 ℃,但 MBP-hepA 的热稳定性较差,在 30 ℃下的半衰期仅为 10 min,因此若在较高温度下反应由于酶的失活会导致反应很快结束。实验表明,该融合酶在 15 ℃却能表现出极好的稳定性,保存 58 h 后还能够保持100%的酶活,故反应温度应选择 15 ℃。
在该酶解反应中,低分子肝素产品的平均分子量与各寡糖含量有着密切的联系,反应时间越长,则产品降解越充分,得到的低分子量肝素平均分子量越小。利用 MBP-hepA 融合酶,通过控制反应时间,可得到理想的低分子量肝素( LMWH, Mw<3500)和超低分子量肝素( uLMWH, Mw<2500)。超滤膜酶反应体系实验结果表明, 10mL MBP-HepA ( 2184IU/L)酶液与 200mL含肝素钠 25g/L的底物溶液反应,充分反应后反应混合物经过截留分子量 5000的超滤膜包( Millpore 公司)后得到的滤过液中低分子量肝素产物的重均分子量仅为 1375,分布系数仅为 1.2,重量收率为 80%左右,已经达到超低分子量肝素的要求。所以在酶解过程中 MBP-hepA 融合酶可以几乎不损耗活力,稳定性很好,利用膜酶反应器可以循环使用。
3 应用说明
目前,酶降解法中的肝素酶产品来源主要是肝素黄杆菌( Flavobacterium heparinum)中肝素酶 I 的分离纯化。但此法所得到的肝素酶产量低、纯化困难,造成酶的成本非常昂贵,也极大地限制了酶法制备低分子肝素的发展。而利用重组菌株生产肝素酶 I 是一条极有前景的途径,但通常的表达体产生的肝素酶 I 容易形成包涵体,无法直接利用。
清华大学在多年来一直致力于开发高效的肝素酶生产技术,解决肝素酶应用的成本问题的研究,从一株肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶 I 的基因,利用融合蛋白技术构建了高效生产可溶性的肝素酶 I 的基因工程菌株,实现了可溶肝素酶 I 的生产,获得了很高的酶活。研究表明,该重组可溶肝素酶 I 能和商品肝素酶一样有效地降解肝素, 制备出理想的 LMWH。通过控制酶解反应条件,可得到平均分子量在 5000~6000 的低分子量肝素寡糖。另外,利用膜生物反应器通过控制酶反应时间和酶量,还能够制备出目前国际上备受关注超低分子量肝素(平均分子量 2000~3000 左右)。所以该融合表达法是一种具有广泛应用前景的低成本生产肝素酶 I 的方法。该法得到的重组肝素酶 I 只需进行一步亲和层析就能达到 95%的纯化效果;同时利用融合蛋白的亲和吸附能力容易实现肝素酶 I 的定向固定化;融合酶的稳定性高,使酶的反复使用成为可能,从而提高酶反应效率,降低酶的使用成本和低分子量肝素的生产成本。实验结果表明,该融合酶摇瓶培养的酶活可以达到 16000IU/L, 5L 发酵罐生产酶活达到了 20000IU/L 以上。由于该重组肝素酶 I 的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度降低,因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法蕴含巨大的工业应用价值。根据前期的研究结果,估算融合肝素酶的生产成本大约为 50 元/100IU。
酶降解法目前已经被用作分析肝素的结构和制备低分子肝素( LMWH) /超低分子量肝素( uLMWH)。该法普遍采用的酶是从肝素黄杆菌中分离纯化出肝素酶Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ三种,它们能够特异性地裂解肝素链上具有特殊结构的不同序列,从而产生不同的寡糖片段。肝素酶作用的基本过程是使己糖胺和糖醛酸之间的键断裂, 在非还原末端生成 4,5-不饱和艾杜糖醛酸, 该还原末端在 230~235 nm 处有明显吸收,而此吸收值又与降解产物中的肝素分子量有一定关系,因此可以通过测量 230 nm 处的吸收度来控制产品质量。低分子量肝素产品的分子量主要是通过反应时间、酶的用量、反应液的 pH 值等因素来调整。另外如果使用固定化肝素酶降解肝素,产品和肝素酶易于分离,生产方便,酶可反复使用,可节约成本。固定化酶和超滤法联用可精确的控制产物的分子量,并实现生产的自动化。
本技术生产的 MBP-hepA融合酶可以满足上述的要求,高效地用于低分子肝素 ( LMWH)/超低分子量肝素( uLMWH)的制备。同时设计了一套超滤膜酶反应体系。实验结果表明,通过控制酶反应时间和酶量,可以制备出平均分子量在 5000~6000 并符合欧洲药典要求(抗Xa 活性不得低于 70 IU/mg,抗 Xa 与抗 IIa 活性比值不得低于 1.5)的低分子量肝素产品和目前国际上备受关注超低分子量肝素(平均分子量 2000~3000 左右)。该项目已申请专利 5项,并获得 2007 年第十七届全国发明展览会银奖。
4 合作方式
商谈。